优化Western Blotting的技巧

蛋白質印迹不是一門精確的科學,特別是在方法論意義上,直接獲得**的,出版物就緒的結果並不是常態。但是,您可以采取一些步驟來優化Western印迹實驗,並確保它們能夠以**佳方式開始。這種微調過程稱爲優化,Western印迹方案的幾個階段可以從中受益。

1. SDS-PAGE

您的蛋白质印迹实验早在您获得膜之前就开始了。你可以追溯到样品制备,但为了空间的利益,让我们从样品分离开始。通过这个,你可以得到你放入的东西 - 如果没有一个好的凝胶,你将无法得到一个好的膜,它将从那里向下螺旋。如果你自己涂上凝胶,要特别注意确保化妆的均匀性。选择正确的丙烯酰胺百分比(参见Proteintech的  Western blot协议 [PDF])。通过抵抗在高电压下运行凝胶的诱惑并使用等效体积的1x样品缓冲液填充空孔,避免染色前“微笑”效应。

**重要的是,加入均勻量的蛋白質; 通過測定確定蛋白質濃度,並准備減少您的裝載量,如果您獲得“條紋”印迹。Proteintech驗證實驗室發現,每個泳道30μg蛋白質通常會産生無條紋和良好分離的條帶。

2.膜

您的膜選擇可以對Western印迹實驗的結果産生巨大影響。主要的兩種膜類型是PVDF和硝酸纖維素,但現在消費品市場上有幾種版本,包括例如針對基于熒光的免疫檢測優化的膜或低分子量蛋白質。

PVDF因其韌性,穩定性和對大多數酸和堿的耐受性而受到重視(這意味著它是那些希望剝離和重新探測印迹的人的**膜)。PVDF膜還提供比硝酸纖維素更好的蛋白質保留。

硝酸纖維素膜易于堵塞,通常可提供高信噪比。但是,你將無法剝離和重新探測它們。並注意硝酸纖維素膜的孔徑。

**後,關于實驗室傳統的一句話:不要害怕因實驗室規範而改變膜類型。嘗試不同的東西可能是**蛋白質印迹的關鍵。

3.抗體濃度

假設您已經付出了所需的努力來  選擇您的抗體(Proteintech也提供了指南),您的下一步應該是確定**佳的工作抗體濃度。

抗体与抗原之间的结合速率(亲和常数)受其在溶液中的相对浓度(以及其他变量,如温度和pH)的影响。抗原丰度通常在Western印迹中固定,因此您通常需要调整抗体浓度以获得更好的印迹。以有组织的方式进行此操作 - 测试几种稀释的抗体,同时保持所有其他参数不变 - 将帮助您确定实验的**佳抗体浓度。

此步驟稱爲抗體滴定,應在每次使用新抗體或一組實驗條件時進行。如果您注意到新批次的多克隆抗體與**後一批抗體的表現不同,也應該這樣做。

如何滴定抗體

許多公司在其抗體數據表中提供了推薦的稀釋度,這些通常是很好的球場數據,可以幫助您入門; 然而,仍然建議滴定抗體,因爲用于獲得推薦稀釋度的條件可能與您自己的非常不同。如果韩国黄片數據表建議使用1:1000的稀釋度,請嘗試1:250,1:500,1:1000,1:2000和1:4000的系列。

一般情况下,如果您将推荐的稀释液加上推荐稀释液的两倍和一半稀释液(另一侧稀释液稀释液),您将处于正确的轨道上。如果没有推荐的稀释液开始,请尝试1μg/ ml的纯化抗体作为起点。请记住保持所有其他协议参数相同,例如样品类型,孵育时间,洗涤时间和温度。

關于二抗的說明

也许你必须尝试不同浓度的二抗 - 特别是在化学发光检测的情况下。HRP标记的第二抗体的浓度直接影响条带的外观。HRP酶太少会导致化学发光信号低,光谱或光谱缺失。另一方面,过高的浓度会产生“烧坏”的条带。这是由于衬底的快速耗尽导致中间没有信号的带。化学发光试剂孵育的长度也会有所不同(参见下面的#6,检测)。

4.阻塞條件

可以使用各种阻塞缓冲区,这些缓冲区都不适用于所有情况。为每个抗体 - 抗原对尝试几种阻断缓冲液是很重要的。请记住,基于乳汁的阻断缓冲液含有内源性生物素,糖蛋白和可能干扰信号的酶。例如,含乳的缓冲液含有活性磷酸酶,会破坏您对磷酸化蛋白质的检测; 在这些情况下,尝试替代品,如牛血清白蛋白基阻滞剂。

5.洗滌

在大多數情況下,每當我有高背景信號時,修改下一次貫穿的洗滌步驟已被證明是有用的。通常,我通過將吐溫-20濃度從0.05%增加到0.1%來實現這一點。您還可以使用以下任何一種策略來改變洗滌強度:增加洗滌時間和體積,執行額外的緩沖液更換或使用更強的洗滌劑(例如,SDS代替吐溫20)。

6.檢測

检测阶段对于获得良好的Western印迹信号是不可或缺的。有许多化学发光试剂和化学发光替代品,如荧光检测 - 所以如果你目前的检测方法不符合实验室标准,有很多选择。例如,您可以选择具有更高灵敏度的试剂或产生更持久信号的试剂。后一种选择将不可估量地增加印迹的再现性。

在更简单的水平上,化学发光检测可以通过胶片曝光时间进行优化。这可能是**常执行的优化步骤,因为它快速而简单。始终将您的墨水暴露在一系列单独的时间点(但请记住,大约10到15分钟后,所有HRP底物将用完)。你的电影选择也会有所作为。我总是发现专门用于化学发光检测的胶片 - 而不是任何标准的放射敏感胶片 - 是**佳选择。

虽然荧光成像系统可能尚未供每个实验室使用,但您所在机构可能会提供核心或中心设施来提供此技術。基于荧光的检测系统的直接优势是它们能够同时检测多种抗体,无需剥离和重新探测您的印迹。

或者,您可以完全跳過一級抗體的二次檢測,並簡化您的Western印迹方案,使用HRP結合的一抗識別常見的上樣對照和蛋白標簽。(以下列出的相關韩国黄片均以此格式提供。)

优化的主要目的是增加特定波段的信噪比并减少非特定波段(如果存在)。不可否认,如果您选择优化上述所有变量,则需要花费大量时间; 然而,即使是一两次改动也可能有所不同,从长远来看实际上可以省时间。总的来说,我认为优化是一项非常有价值的工作 - 如果你想获得出版品质的西方印迹,那么这是一项必要的策略。

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