成功傳代培養的技巧:根據您的細胞系定制解離方法

在開發特定細胞系的培養條件時,需要考慮許多參數。我們都知道pH平衡,氧氣水平和血清濃度是導致培養成功或失敗的重要變量。然而,包括與細胞需要相匹配的解離方法的亞培養方案同樣重要。考慮到這一點,我們將審查一些常見的解離實踐背後的原理,以幫助您根據細胞系的特定性質定制您的方法。

懸浮生長的細胞易于亞培養。只要將細胞稀釋到合適的新鮮培養基中,然後用完它們的營養供應,它們就會很好。另一方面,以單層生長的細胞彼此之間以及與培養皿發生蛋白質接觸。必須先打破這些細胞,然後將細胞懸浮在培養基中,旋轉並重新鋪板。因此,必須特別考慮確保解離條件破壞細胞接觸而不殺死細胞。

胰蛋白酶有時候,但並非總是如此

在決定解離條件時,研究者應考慮細胞産生的鍵的類型。一些貼壁細胞系僅産生微弱的接觸,可以通過簡單地將培養瓶撞擊在您的手掌上,或通過將燒瓶輕敲在台面上來破壞。其他貼壁細胞系,特別是來自上皮細胞的貼壁細胞系,可形成強大的多蛋白質緊密連接,只能通過酶消化破壞; 在這些情況下,經常使用胰蛋白酶(絲氨酸蛋白酶)。來自上皮的細胞也可以表達鈣粘蛋白,其介導非常強的鈣依賴性粘附物或橋粒連接。在這種情況下,可能需要添加鈣螯合劑(如EDTA)來螯合鈣,以有效地解離細胞。

分離後優化活力

为了在解离后优化细胞活力,反应条件应与细胞接触的强度相匹配。例如,如果标准胰蛋白酶/ EDTA消化(通常0.05%-0.5%)不能有效消化细胞键(在10-15分钟内),则可能难以在细胞开始死亡之前从细胞中除去细胞,并且细胞活力将受到不利影响。在这种情况下,可能需要更高浓度的胰蛋白酶/ EDTA或其他酶,例如胶原酶。另一方面,如果反应太苛刻,细胞可能裂解或丢失重新附着到板上所需的表面蛋白质,并且任一情况都将导致活力降低。此外,裂解的细胞释放基因组DNA,导致活细胞结块,使存活细胞更难重新培养,并且需要添加DNase。

准備是良好分離的關鍵

如果您已将反应强度与细胞系的粘附特性相匹配,但您的细胞仍难以去除,您可能会发现问题在于细胞准备解离的方式。在生长培养基中可能存在抑制胰蛋白酶的元素,例如血清,但是这可以通过在添加解离试剂之前用Dulbecco's PBS(不含钙或镁)简单地冲洗细胞一次或两次来克服。也可能是细胞保持融合的时间过长。在这些条件下,细胞可能会形成特别强的细胞 - 细胞和细胞 - 表面连接,这些连接特别难以破碎。出于这个原因,以及培养物的整体健康状况,建议细胞在融合之前进行传代(即,

結論

通過對解離試劑的工作原理的基本了解,研究人員可以開發出一種優化的方案,該方案同時考慮細胞粘附性的強度和質量。優化的細胞解離方案將確保成功的傳代培養並延長培養細胞的壽命。

 

Carolyn Peluso博士是ATCC的技術作家和细胞生物学专家。

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